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Introduction
De nombreuses données épidémiologiques
ont permis d'établir une relation causale entre l'infection chronique par virus de
l'hépatite B (VHB) et le développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Pourtant,
le VHB ne porte aucun gène oncogène dominant et les mécanismes moléculaires impliqués
dans le processus tumoral restent très mal connus. Différentes hypothèses ont été
avancées sur le rôle du virus de l'hépatite B dans la -carcinogénèse hépatique:
- soit un rôle indirect par activation de
la réponse immunitaire, qui induirait une maladie nécroinflammatoire et une
régénération favorable à l'accumulation d'altérations génétiques
- soit un rôle de cofacteur de l'expression à long terme des protéines virales,
notamment le transactivateur HBx et certaines formes de protéines d'enveloppe
- soit un rôle mutagène de l'intégration de lADN viral dans le génome cellulaire, par
mutagenèse insertionnelle directe ou par induction d'instabilité génétique. (Il faut
noter que ces hypothèses ne sont pas mutuellement exclusives).
Dans ce contexte, l'étude de modèles animaux naturels et
expérimentaux apporte des renseignements précieux sur les voies possibles de la
transformation hépatocellulaire induite par le VHB.
Les modèles de la marmotte et de l'écureuil
Le VHB est le prototype d'une petite
famille de virus à ADN hépatotropes, les hépadnavirus. Ces virus infectent un singe du
nouveau monde, le wooly monkey (WMHBV), la marmotte (WHV), différents types d'écureuils
(GSHV et ASHV) et certains oiseaux comme le canard (DHBV), l'oie, le héron et la cigogne.
Tous ces virus partagent une même structure du virion et une même organisation
génétique. Les virus aviaires sont plus éloignés; ils semblent plus anciens et ne
portent pas de gène X. Les propriétés biologiques communes aux hépadnavirus incluent:
- un tropisme préférentiel pour
l'hépatocyte
- un spectre d'hôte très étroit
- un mode particulier de réplication par réverse transcription d'un ARN intermédiaire -
la capacité d'induire des infections persistantes
- l'association au cancer du foie pour les virus hepadna de mammifères (WHV et GSHV) mais
pas pour les virus aviaires..
Ces virus ont été largement utilisés pour
étudier les propriétés du VHB, notamment le virus du canard pour la réplication virale
et le virus de la marmotte pour la pathogénèse et la relation au cancer
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La
mutagenèse insertionnelle
La découverte de séquences virales
intégrées dans le génome des cellules tumorales dans plus de 80% des tumeurs associés
au VHB a suggéré que le virus pourrait jouer un rôle mutagène semblable à celui de
certains rétrovirus. En effet, bien que l'intégration du virus ne joue aucun rôle dans
la réplication, des séquences défectives et réarrangées peuvent fréquemment
s'intégrer au hasard dans les chromosomes cellulaires par un mécanisme non spécifique
encore mal connu. On peut même trouver des séquences intégrées du VHB dans des tumeurs
de sujets séronégatifs pour AgHBs, infectés ou non par le virus de l'hépatite C. Au
cours des 20 dernières années, de nombreuses études visant à identifier des gènes
cellulaires cibles ont permis de mettre en évidence plusieurs cas de mutagenèse
insertionnelle. Il s'agissait chaque fois d'un gène différent dans une tumeur unique:
les gènes codant pour le récepteur à l'acide rétinoique, la cycline A2, la mévalonate
kinase et la protéine SercA1 du réticulum. Curieusement, aucun de ces gènes n'est un
oncogène répertorié, mais tous sont impliqués dans le contrôle de la prolifération,
de la viabilité ou de la différenciation cellulaires. Dans tous ces cas, l'insertion de
séquences virales dans le gène a conduit à l'activation d'un promoteur intégré du
VHB, et la production de protéines chimériques portant des séquences virales et dont
l'activité biologique était altérée. Dans d'autres cas, l'intégration du VHB
s'accompagne de grands réarrangements chromosomiques suggérant que le virus peut exercer
un effet à grande distance ou induire une instabilité génétique.
C'est dans le modèle de la marmotte infectée par le virus WHV que la mutagenèse
insertionnelle joue vraiment un rôle prédominant. En effet, dans près de 90% des
tumeurs, l'intégration virale affecte un gène de la famille myc: c-myc, N-myc, ou, plus
fréquemment, N-myc2, un gène sans introns spécifique de la marmotte et de l'écureuil.
Les séquences virales comportant systématiquement les enhancers du virus peuvent
s'intégrer à proximité immédiate (en 5' ou en Y) de la région codante du gène myc
cible. Le promoteur de ce gène myc est activé par l'intégration de l'ADN viral,
produisant soit un ARN de taille normale, soit un transcrit hybride viral/cellulaire
codant pour la protéine myc normale. Il s'agit dans ce cas d'une activation par insertion
de l'enhancer. De plus, dans 25% des tumeurs, l'intégration du virus WHV dans le locus
win situé à 200 kb en aval de N-myc2 induit l'activation du promoteur N-myc2 par effet
de l'enhancer à grande distance. La dérégulation. de l'expression des oncogènes myc a
été impliquée dans de nombreux types de cancers chez l'homme et l'animal. Ces gènes
jouent un rôle crucial dans le contrôle de la prolifération cellulaire, de la
différenciation et de l'apoptose. Les modèles transgéniques de carcinogénèse
hépatique ont démontré que l'activation des gènes myc était l'un des événements
oncogéniques les plus puissants dans la transformation des hépatocytes. En particulier,
des lignées de souris portant le gène c-myc ou N-myc2 de marmotte activé par insertion
du virus WHV développent presque systématiquement des cancers du foie.
Par contre, dans le modèle de l'écureuil infecté par le virus GSHV, aucun rôle de la
mutagenèse insertionnelle par intégration de l'ADN viral n'a pu être observé. Aucune
intégration n'a été détectée dans les gènes c-myc et N-myc2 d'écureuil. De plus,
des marmottes infectées par le virus GSHV développent des CHC dans lesquels le virus
n'est pas intégré dans les gènes myc, ce qui indique que des déterminants viraux
jouent un rôle prépondérant dans le processus. Par ailleurs, le cancer se développe
plus lentement chez les animaux infectés par GSHV. Cependant, le gène cmyc est encore
impliqué dans ces tumeurs, puisqu'une amplification génétique de 5 à 30 fois de ce
gène a été détectée dans près de la moitié des cas.
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Modèles expérimentaux: les souris transgéniques
Les modèles transgéniques murins ont été
largement utilisés pour étudier, dans un petit animal de laboratoire, les mécanismes de
la réplication de différents virus, leur tropisme tissulaire, les pathologies associées
et la fonction biologique de différentes protéines virales. En effet, ce système offre
sur les cultures cellulaires l'avantage de pouvoir analyser des fonctions biologiques et
pathologiques dans le contexte d'un organisme entier. De plus, dans le cas du VHB,
l'absence de cultures d'hépatocytes humains différenciés rend très difficile l'étude
in vitro des propriétés transformantes du virus. De nombreuses lignées de souris
transgéniques portant en totalité ou en partie le génome du virus B ont été
élaborée dans divers laboratoire. L'expression des gènes viraux est majoritairement
localisée dans le foie, montrant que des mécanismes de régulation sont fortement
impliqués dans le tropisme hépatique du virus, indépendamment de la présence du
récepteur viral à la surface des hépatocytes. Par ailleurs, l'expression des gènes
viraux est souvent plus élevée chez les mâles que chez les femelles, ce qui conforte
des observations réalisées chez l'homme. Les souris portant un génome VHB complet sont
capables de réaliser toutes les étapes de la réplication virale, et le foie sécrète
des particules virales infectieuses ainsi qu'un large excès de particules d'enveloppe
défectives de 22 nm. Ces données indiquent que la barrière d'espèce pour l'infection
par le VHB ne s'exerce pas au niveau de la réplication, mais au niveau de l'entrée du
virus, probablement car le VHB utilise un récepteur mal conservé dans l'évolution.
En majorité, les lignées transgéniques pour le VHB ne développent aucune pathologie,
bien que certaines produisent du virus en quantité importante. Cette observation conforte
l'idée que la réplication du VHB n'a aucun effet cytolytique direct sur l'hépatocyte
infecté. Il faut noter que les souris transgéniques sont immunotolérantes pour les
produits du transgène, et qu'aucune réaction immunitaire ou inflammatoire n'est
observée dans ces animaux. Il existe pourtant deux modèles montrant un effet
turnorigénique de deux protéines virales.
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Les
protéines d'enveloppe
Le groupe de Frank Chisari à la Scripps Clinic (La Jolla, USA) a élaboré des souris
qui surexprîment la grande protéine d'enveloppe du VHB (LHBs) par rapport à la petite
protéine d'enveloppe. Chez ces animaux, la rétention de LHBs dans le réticulum
endoplasmique provoque une accumulation anormale dans les hépatocytes, associée à une
morphologie typique de cellules "en verre dépoli" souvent observée dans les
hépatites B chroniques. Ceci provoque une pathologie évoluant lentement mais
inexorablement vers le cancer. On ignore encore actuellement la nature des événements
moléculaires de la transformation maligne dans ce système: aucun gène cellulaire
oncogène ou anti-oncogène n'a pu être impliqué. La protéine pourrait agir directement
via des interactions avec certains partenaires cellulaires, ou son rôle pourrait être
très indirect. Il existe chez l'homme des cas de tumeurs dans lesquelles la rétention
d'une autre protéine d'enveloppe du VHB (une forme tronquée de la protéine moyenne) a
été associée au processus tumoral. En effet, l'intégration de du VHB est souvent
associée à des remaniements des séquences virales, qui peuvent conduire à la formation
de protéines MHBs tronquées de la partie carboxy-terminale. Ces protéines mutantes ne
peuvent être sécrétées et s'accumulent dans les membranes du réticulum endoplasmique;
elles présentent de plus une activité transactivatrice qui peut contribuer à la
dérégulation de l'expression de différents gènes cellulaires.
Des arguments solides en faveur d'un rôle indirect de la réponse immunitaire dans le
développement du CHC associé au VHB a été récemment apporté par un autre travail du
groupe de Frank Chisari. Ce groupe a élaboré des souris transgéniques pour la petite
protéine d'enveloppe (SHBs) qui produisent de grandes quantités de particules de 22 nin
sans développer de pathologie, car elles sont immunotolérantes. En parallèle, des
souris nontransgéniques ont été immunisées avec le vaccin antiVHB dirigé contre
l'antigène d'enveloppe AgHBs. Si l'on transféré les lymphocytes T issus des souris
immunisées dans les transgéniques SHBs, il apparaît une réaction inflammatoire qui
mimique l'hépatite B aigue. Des transferts répétés de lymphocytes T activés finissent
après une longue latence par induire l'apparition de carcinomes hépatocellulaires. On ne
connait pas encore les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la carcinogénèse
hépatique dans ce modèle.
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Le
transactivateur HBx
Le second modèle, celui du transactivateur X est plus contesté. En effet, le groupe
de Gilbert Jay a établi une lignée de souris qui surexpriment la protéine virale HBx
dans le foie, et développent des lésions hépatiques qui évoluent très fréquemment
vers le carcinome hépatocellulaire. Une forte augmentation de la prolifération des
hépatocytes est observée aux stades prénéeplasiques, ainsi qu'une inhibition des
fonctions de p53, vraisemblablement par la formation d'un complexe cytoplasmique entre p53
et HBx. Il faut noter que ces souris ont un fond génétique CD1, une souche spontanément
très susceptible au développement de cancer du foie. Par contre, plusieurs autres
lignées murmes exprimant la protéine X dans le foie dans d'autres fonds génétiques ne
développent aucune pathologie. Cependant, elles deviennent plus sensibles à la
carcinogénèse chimique. Nous avons de plus montré que l'expression d'HBx coopère avec
c-myc en accélérant l'apparition des CHC. L'ensemble de ces données suggère que le
transactivateur viral ne possède pas d'activité oncogénique dominante, mais pourrait
contribuer au processus tumoral en jouant un rôle de cofacteur ou d'agent promoteur de
tumeurs.
De même, le gène X n'est pas capable d'induire la transformation de cellules en culture.
Cependant, dans certains types de cellules (hépatocytes immortalisés par TGFa ou par
l'antigène T de SV40), l'expression dHBx peut induire le phénotype transformé. Les
mécanismes d'action d'HBx restent mal connus. Par son action de transactivateur
transcriptionnel, HBx pourrait activer l'expression d'oncogènes comme c-myc, c-fos et
c-jun. HBx pourrait interagir avec p53 et inhiber les fonctions de suppresseur de tumeurs
de cette protéine; il interagit aussi avec une protéine impliquée dans la réparation
de l'AON (UVDDB) et avec le protéasome. Par ailleurs, il est important de savoir que la
surexpression d'HBx dans des cellules transfectées induit la mort cellulaire programmée
ou apoptose. Nous avons également montré que l'apoptose hépatocellulaire spontanée est
augmentée chez les souris transgéniques pour le gène X. Ces données suggèrent que
cette protéine pourrait activer le processus nécrorégénératif associé chez l'homme
à l'hépatite B chronique, favorisant ainsi l'apparition d'altérations génétiques.
Enfin, il faut noter que dans les CHC humains associés au VHB, le gène X est très
souvent intégré sous forme sauvage ou mutée.
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Conclusions
Les modèles animaux naturels et
expérimentaux ont fourni de très intéressantes pistes pour l'étude des propriétés
transformantes du virus de l'hépatite B. Notamment, le développement de cancer du foie
chez les marmottes et les écureuils infectés par des virus étroitement apparentés au
VHB est un argument très fort montrant que les virus de cette famille partagent des
propriétés tumorigéniques. Pourtant les virus WHV et GSHV utilisent apparemment des
voies différentes pour transformer les hépatocytes infectés: la mutagénèse
insertionnelle des gènes myc est une propriété particulière au virus de la marmotte.
Ceci indique que l'intégration des différents hépadnavirus ne joue pas le même rôle,
sans que l'on connaisse actuellement la nature des déterminants viraux impliqués dans
une telle différence. Il faut donc être conscient des limitations deces modèles.
L'étude de souris transgéniques pour le génome du VHB ou pour certains gènes viraux a
également montré la contribution potentielle des protéines d'enveloppe, de la réponse
immunitaire et du gène transactivateur X dans le processus d'hépatocarcinogenèse.
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Introduction
Les modèles de la marmotte et de
l'écureuil
La
mutagenèse insertionnelle
Modèles expérimentaux: les
souris transgéniques
Les
protéines d'enveloppe
Le
transactivateur HBx
Conclusions
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Les modèles de la marmotte et de
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