Les vecteurs

Les vecteurs viraux sont actuellement les plus utilisés. Ils sont principalement de deux types : les virus à ARN représentés par les rétrovirus et les virus à ADN, surtout représentés par les adénovirus. Les vecteurs non viraux, physico-chimiques, de nature phospho-lipidique comme les liposomes, sont conceptuellement très intéressants puisqu'ils peuvent être synthétisés et évitent les risques inhérant à l'utilisation des virus mais sont d'efficacité très limitée pour l'instant.

Les rétrovirus sont actuellement les plus utilisés (1). Il s'agit de virus dont les gènes propres ont été supprimés, donc incapables de se répliquer, et dans lesquels le gène étranger à transférer a été placé. Ce type de virus pénètre dans les cellules cibles grâce à des récepteurs membranaires. Le transgène pénètre dans le noyau et s'intègre à l'ADN chromosomique. Un des risques liés à l'utilisation de ce type de virus est la possibilité de recombinaison avec d'autres rétrovirus sauvages restaurant leurs potentialités de réplication. Chaque rétrovirus ne peut infecter qu'une seule cellule puisqu'il est défectif. Surtout, il ne peut infecter qu'une cellule en phase de synthèse d'ADN (phase S), donc en cours de division, ce qui rend son utilisation favorable pour les cellules cancéreuses. Le risque de cette insertion génomique qui est aléatoire, est d'entrainer une mutation insertionnelle au voisinage d'un gène proto-oncogène. Néanmoins, ce risque est vraisemblablement très faible et aucun cancer n'a été observé après transfert rétroviral de gène chez l'animal. Un autre risque de l'utilisation de ce type de virus est l'infection des cellules germinales en cas de diffusion systémique.

Les adénovirus sont des virus à ADN capables d'infecter in vivo un fort taux de cellules quiescentes de divers tissus, notamment le foie (2). Des concentrations très élevées de particules virales peuvent être obtenues et jusqu'à 100 p.cent des hépatocytes peuvent être infectés in vitro ou in vivo après injection systémique ou par voie biliaire. Ils peuvent contenir de longs fragments d'ADN, jusqu'à 35 kb. Le plasmide véhiculé par les adénovirus demeure dans le cytolol et l'ADN n'est pas intégré au génome cellulaire ce qui diminue le risque de mutagénèse insertionnelle. En revanche, cette absence d'intégration rend l'expression du transgène limitée dans le temps. Le principal inconvénient de ce type de virus est la réaction inflammatoire qu'ils entraînent dans le tissu infecté, notamment au niveau du foie. De plus des injections répétées d'adénovirus est à l'origine de la formation d'anticorps qui inactivent très rapidement les virus des injections itératives.

Les nouveaux vecteurs viraux (3) sont représentés essentiellement par les virus associés à l'adénovirus ou AAV et les lentivirus.

AAV : les virus associés à l'adénovirus ou AAV sont des particules à ADN non pathogènes incapables de réplication en l'absence d'un autre virus comme l'adénovirus. Ils peuvent infecter de nombreux types cellulaires comme les hépatocytes, les neurones, les cellules musculaires, et incorporent leur ADN dans le chromosome 19 chez l'homme. Leur principal inconvénient est la petite taille de l'insert qu'ils peuvent contenir. Leur production à grande échelle n'est pas encore standardisée.

Les lentivirus : dérivés du virus de l'immuno-déficience humaine et appartenant à la famille des rétrovirus, les lentivirus sont susceptibles d'infecter les cellules en division ainsi que certaines cellules quiescentes comme les neurones, les cellules hématopoïétiques ou les cellules rétiniennes. En revanche, elles infectent dans des proportions très modestes les hépatocytes et les cellules musculaires quiescents (9). Ces vecteurs permettent une expression prolongée du transgène de plus de 6 mois chez le rongeur. Ils ne semblent pas induire de réaction immune spécifique. La taille de l'insert est assez faible (7 kb) et leur production ne peut encore se faire à grande échelle.

Les liposomes sont des composés lipidiques qui peuvent transporter différentes molécules et en particulier de l'ADN plasmidique, même de grande taille. Les progrès dans leur synthèse ont surtout été marqués par l'apparition de lipides chargés négativement : les liposomes cationiques qui s'intègrent à la membrane plasmique de la cellule-cible et sont incorporés par endocytose. De telles substances ont fait la preuve de leur efficacité pour délivrer de l'ADN dans de nombreux types cellulaires tant in vitro qu'in vivo. L'association des liposomes à des asialo-glycoprotéines leur confèrent un tropisme sélectif pour les hépatocytes qui possèdent des récepteurs pour ce type de glycoprotéine. L'injection de liposomes cationiques dans la circulation systémique est toutefois décevante car ils activent souvent le complément, peuvent être responsables d'immunisation et sont rapidement détruits par le système phagocytaire mononucléé. Ils paraissent surtout efficaces en utilisation locale, injection dans un tissu ou une tumeur par exemple. Toutefois, de nombreux problèmes liés à leur utilisation ne sont pas encore réglés et les rendent moins efficaces pour l'instant que les virus : leur biodisponibilité, la faible et brève expression du transgène principalement (4).

Les méthodes de transfert et leur sélectivité

Deux principales méthodes peuvent être envisagées pour tranférer un gène dans une tumeur hépatique (3). La première consiste à injecter les vecteurs directement dans la circulation systémique ce qui suppose un tropisme électif et une sélectivité des vecteurs pour les cellules tumorales hépatiques afin d'éviter de transfecter les hépatocytes sains et les organes extra-hépatiques. La seconde consiste à injecter les vecteurs directement dans la tumeur ou dans la circulation hépatique : veine porte ou artère hépatique. Cette injection vasculaire est encore plus efficace lorsqu'elle est accompagnée d'une exclusion vasculaire complète du foie (5).

Gènes candidats et stratégies de traitement du CHC

Le transfert implique celui du gène thérapeutique ainsi qu'un promoteur qui en contrôle l'expression et dont le choix est crucial pour permettre de cibler les cellules tumorales. Plus de la moitié des CHC surexpriment l'alpha-foeto-protéine (AFP). Ainsi, l'utilisation du promoteur du gène de l'AFP permet l'expression spécifique du gène thérapeutique dans les cellules tumorales qui produisent l'AFP, de façon propotionnelle à ce niveau de production (6).

Les gènes "suicide". Il s'agit de transférer un gène codant pour une protéine enzymatique capable de transformer une pro-drogue non toxique en un composé toxique pour les cellules tumorales entraînant leur apoptose. Le modèle le plus utilisé est celui du gène de la thymidine kinase du virus Herpes Simplex. Cette enzyme transforme le ganciclovir en dérivé triphosphaté toxique pour les cellules cancéreuses en cours de division. De plus, ce système s'accompagne d'un effet de coopération métabolique ("bystander effect") qui est à l'origine de l'apoptose des cellules de voisinage par diffusion des dérivés toxiques. Enfin, il existe dans certains modèles animaux, après traitement d'une seule tumeur hépatique, une action à distance sur d'autres tumeurs non traitées, sans doute par effet immunitaire. Ce modèle s'est avéré efficace in vitro sur des lignées d'hépatome (7), mais aussi in vivo chez la souris (8).

Les gènes "suppresseurs" de tumeur. Le plus connu est celui codant pour la protéine p53. De très nombreux cancers (dont le CHC) s'accompagnent d'une mutation ou d'une inactivation du gène de p53 (9). La restauration de la fonction de cette protéine est susceptible d'entraîner l'apoptose des cellules tumorales. Ainsi, il a été montré que le transfert adénoviral du gène de p53 permettait l'arrêt de la croissance tumorale chez le rat atteint de CHC (10). De plus, les cellules tumorales transduites par le gène de p53 deviennent sensibles au cisplatine. Le transfert de ce gène a fait l'objet de deux essais cliniques chez l'homme.

L'immuno-stimulation. Différentes données expérimentales ont montré que les cellules tumorales échappent aux défenses immunitaires de plusieurs façons possibles. Les antigènes de membrane des cellules tumorales peuvent être modifiés, notamment la perte des antigènes du CMH de type I. Les cellules tumorales peuvent aussi libérer des facteurs inhibant la réponse immune normale, notamment par un déficit en certaines cytokines. Ainsi, de nombreuses cytokines ont été employées expérimentalement pour stimuler l'immunité anti-tumorale comme IL-2, IL-4, IL-6, TNF?, GM-CSF… Des travaux ont montré la régression de CHC chez le rongeur après transfert adénoviral ou rétroviral de TNF? ou d'IL-2. (11).

Les oligonucléotides antisens. Le but consiste à incativer des oncogènes responsables du développement du CHC tels que c-myc ou N-ras. Le vecteur de transfer véhicule un ARN antisens de ces oncogènes et qui bloque leur production. Des résultats ont été obtenus in vitro sur des lignées de CHC transfectées par des rétrovirus contenant l'ARN antisens de N-ras (12).

Essais cliniques

Deux essais de thérapie génique du CHC ont été réalisés, concernant ous deux le transfert du gène de la protéine p53. Le premier a concerné 5 malades chez qui l'ADN nu de p53 a été injecté par voie per-cutanée. Une réduction significative du volume tumoral évalué au scanner et du taux sérique d'AFP a été notée chez 3 malades (13). Leur survie n'a pas été précisée. Le second essai concerne le transfert adénoviral du gène de p53 par l'artère hépatique. Ses résultats ne sont pas connus ni publiés.

Conclusion

La fréquence, la gravité et la faible efficacité des traitements actuellement disponibles vis-à-vis du CHC incitent à la recherche d'alternatives thérapeutiques comme la thérapie génique. La définition de nouveaux essais cliniques nécessite préalablement d'améliorer les vecteurs actuellement disponibles ainsi que les outils de biologie moléculaire et de définir de façon optimale le ou les gènes thérapeutiques à utiliser.

Références

1- Anderson WF. Prospects for human gene therapy. Science 1984; 226: 401-9. [Abstract Medline PubMed]

2- Wilson JM. Adenoviruses as gene-delivery vehicles. N Engl J Med 1996; 334: 1185-7. [Review. No abstract available on Medline PubMed]

3- Anderson F. Human gene therapy. Nature 1998; 392: 25-8. [Abstract Medline PubMed]

4- Kay M, Liu D, Hoogerbrugge PM. Gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 12744-6. [Full-Text on Proc Natl Acad Sci]

5- Ferry N, Duplessis O, Houssin D, et al. Retroviral-mediated gene transfer into hepatocytes in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 8377-80. [Abstract Medline PubMed Full-text en format pdf à charger (1154K)]

6- Arbuthnot P, Bralet MP, Thomassin H, Danan JL, Bréchot C, Ferry N. Hepatoma cell-specific expression of a retrovirally transfered gene is achieved alpha-foetoprotein but not insulinlike growth factor II regulatory sequences. Hepatology 1995; 22: 1788-96. [Abstract Medline PubMed]

7- Qian C, Bilbao R, Bruna O, Prieto J. Induction of sensitivity to ganciclovir in human hepatocellular carcinoma cells by adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase. Hepatology 1995; 22: 118-23. [Abstract Medline PubMed]

8- Qian C, Idoate M, Bilbao R, et al. Gene transfer and therapy with adenoviral vector in rats with diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma. Hum Gene Ther1997; 8: 349-58. [Abstract Medline PubMed]

9- Weinberg RA. Tumor suppressor genes. Science 1991; 254: 1138-46. [Review. Abstract Medline PubMed]

10- Anderson SC, Johnson DE, Harris MP, et al. p53 gene therapy in a rat model of hepatocellular carcinoma: intra-arterial delivery of a recombinant adenovirus. Clin Cancer Res 1998; 4: 1649-59. [Abstract Medline PubMed]

11- Cao G, Kuriyama S, Du P, et al. Complete regression of established murine hepatocellular carcinoma by in vivo tumor necrosis factor alpha gene transfer. Gastroenterology 1997; 112: 501-10. [Abstract Medline PubMed]

12- Mercola D, Coben J. Antisens approaches to cancer gene therapy. Cancer Gene Therapy 1995; 2: 47-59. [Review. Abstract Medline PubMed]

13- Habib NA, Ding SF, el-Masry R, et al. Preliminary report: the short-term effects of direct p53 DNA injection in primary hepatocellular carcinomas. Cancer Detect Prev 1996; 20: 103-7. [Abstract Medline PubMed]